POSLOVNE INFORMACIJE - 88 20.7.2005 Pravilnik o veterinarsko-zdravstvenim uvjetima za stavljanje kopitara u promet

MINISTARSTVO POLJOPRIVREDE, ŠUMARSTVA I VODNOGA GOSPODARSTVA

1749

Na temelju članka 64. stavka 6. Zakona o veterinarstvu (»Narodne novine« br. 70/97, 105/01 i 172/03.) ministar poljoprivrede, šumarstva i vodnoga gospodarstva donosi

PRAVILNIK

o veterinarsko-zdravstvenim uvjetima za stavljanje kopitara u promet

POGLAVLJE I.OPĆE ODREDBE

Članak 1.

Ovim se Pravilnikom utvrđuju veterinarsko-zdravstveni uvjeti za stavljanje živih kopitara u unutarnji i međunarodni promet.

Članak 2.

Za potrebe ovog Pravilnika pojedini pojmovi imaju sljedeće značenje:

(a) »gospodarstvo« je poljoprivredni ili sportski objekt, staja ili svaki prostor u kojemu se kopitari drže ili uzgajaju, bez obzira na namjenu;

(b) »kopitari« su divlje ili domaće životinje koje pripadaju vrstama konja (uključujući zebre) ili magaraca ili njihovi križanci;

(c) »registrirani kopitari« su svi registrirani kopitari koje prati identifikacijski dokument koji je izdala uzgojna organizacija ili nadležno tijelo države iz koje potječe životinja, a koje vodi matičnu knjigu ili upisnik za tu pasminu, odnosno međunarodno udruženje ili organizacija koja se bavi konjima za natjecanje ili trkaćim konjima;

(d) »kopitari za klanje« su kopitari namijenjeni prijevozu u klaonicu u svrhu klanja, bilo izravno, bilo preko stočnog sajma ili sabirnog centra;

(e) »kopitari za uzgoj i rasplod« su kopitari koji nisu navedeni u točkama (c) i (d) ovoga članka;

(f) »država slobodna od konjske kuge« je država u kojoj nije bilo kliničkih, seroloških (kod necijepljenih kopitara) ili epidemioloških dokaza o konjskoj kugi u prethodne dvije godine i u kojoj se u prethodnih 12 mjeseci nije provodilo cijepljenje protiv te bolesti;

(g) »bolesti kopitara koje se obvezno prijavljuju« su bolesti koje su navedene u Prilogu A ovoga Pravilnika;

(h) »ovlašteni veterinar« je veterinar kojega je ovlastilo nadležno tijelo za obavljanje poslova državne uprave;

(i) »privremeni boravak« je status registrirane životinje koja potječe iz države iz koje je dozvoljen uvoz na područje Republike Hrvatske u razdoblju do 90 dana, a koje određuje nadležno tijelo, ovisno o zdravstvenoj situaciji u državi podrijetla;

(j) »nadležno tijelo« je Uprava za veterinarstvo Ministarstva poljoprivrede, šumarstva i vodnoga gospodarstva.

POGLAVLJE II.

UNUTARNJI PROMET KOPITARA

Članak 3.

1) Nadležno tijelo može odobriti promet registriranih kopitara na svom području odnosno izvoz kopitara u drugu državu ako oni ispunjavaju uvjete utvrđene člancima 4. i 5 ovoga Pravilnika.

2) Nadležno tijelo može odobriti izuzeća u vezi s kretanjem kopitara koji:

– se jašu ili vode, u sportske ili rekreacijske svrhe,

– sudjeluju u kulturnim ili sličnim događajima ili aktivnostima,

– se kreću isključivo zbog privremene ispaše ili rada.

Članak 4.

1) Veterinarsko-zdravstveni pregled kopitara koji se stavljaju u promet, mora se obaviti u razdoblju od 48 sati prije njihovog utovara. Kopitari pri pregledu ne smiju pokazivati kliničke znakove bolesti.

2) Uz posebne uvjete iz stavka 5. ovoga članka, koji se odnose na bolesti koje se obvezno prijavljuju, ovlašteni veterinar utvrđuje, na temelju izjave vlasnika ili uzgajivača, da kopitari nisu u razdoblju od 15 dana prije pregleda bili u doticaju s kopitarima koji boluju ili su sumnjivi na zarazne bolesti.

3) Kopitari ne smiju biti predviđeni za klanje radi provođenja mjera za iskorjenjivanje prenosivih ili zaraznih bolesti.

4) Kopitari se identificiraju na sljedeći način:

– ako se radi o registriranim konjima, pomoću identifikacijske isprave kojom se naročito potvrđuje sukladnost s člankom 5. ovog Pravilnika. Ovlašteni veterinar mora poništiti ispravu tijekom razdoblja zabrana predviđenih stavkom 5. ovoga članka ili člankom 5. ovog Pravilnika. Ukoliko se životinja zakolje, ispravu je potrebno vratiti tijelu koje ju je izdalo;

– kopitari za uzgoj i rasplod identificiraju se u skladu s posebnim propisima.

5) Uz uvjete utvrđene u članku 5. ovog Pravilnika, kopitari ne smiju dolaziti s gospodarstva na kojem:

(a) sve životinje koje pripadaju vrstama prijemljivim na bolest nisu zaklane, a razdoblje zabrane za gospodarstvo s kojeg potječu mora iznositi najmanje:

– šest mjeseci u slučaju kopitara za koje se sumnja da su oboljeli od durine, računajući od datuma posljednjeg stvarnog ili mogućeg doticaja s bolesnom životinjom. U slučaju ždrebadi, zabrana se primjenjuje do trenutka kastracije životinje,

– šest mjeseci u slučaju maleusa ili encefalomijelitisa konja, računajući od dana klanja kopitara oboljelih od navedenih bolesti,

– u slučaju infekciozne anemije kopitara, zabrana mora biti na snazi sve dok se ne zakolju sve zaražene životinje, a preostale životinje negativno reagiraju na dva Cogginsova testa izvedena u razmaku od tri mjeseca,

– šest mjeseci u slučaju vezikularnog stomatitisa,

– mjesec dana od zadnjega zabilježenog slučaja, ukoliko se radi o bjesnoći,

– 15 dana od zadnjega zabilježenog slučaja, ukoliko se radi o bedrenici;

(b) su sve životinje koje pripadaju vrstama osjetljivim na bolest zaklane i prostori dezinficirani. Razdoblje zabrane iznosi 30 dana računajući od dana na koji su životinje eutanazirane i neškodljivo uklonjene te prostori dezinficirani, osim u slučaju bedrenice za koju razdoblje zabrane iznosi 15 dana.

6) Nadležno tijelo može odobriti odstupanje od mjera zabrane za hipodrome i trkališta.

Članak 5.

1) U slučaju pojave konjske kuge, kako je navedeno u članku 2. točki (f) ovog Pravilnika, nadležno tijelo može narediti otpremu kopitara iz onoga dijela područja koje se smatra zaraženim u skladu sa stavkom 2. ovoga članka, jedino pod uvjetima koji su navedeni u stavku 3. ovoga članka.

2) (a) Dio područja se smatra zaraženim konjskom kugom ako:

– klinički, serološki (kod necijepljenih životinja) ili epidemiološki dokazi ukazuju na prisutnost konjske kuge u zadnje dvije godine,

– je u posljednjih 12 mjeseci provedeno cijepljenje protiv konjske kuge.

(b) Dio područja koji se smatra zaraženim konjskom kugom mora obvezno obuhvaćati sljedeće:

– zaštitnu zonu koja se proteže u krugu promjera najmanje 100 km oko središta zaraze,

– nadzornu zonu koja se proteže najmanje 50 km izvan zaštitne zone i u kojoj u posljednjih 12 mjeseci nije provedeno cijepljenje protiv konjske kuge.

(d) U identifikacijskoj ispravi i/ili svjedodžbi o zdravstvenom stanju mora biti jasno navedeno cijepljenje.

3) Kopitari se smiju otpremati iz područja navedenog u stavku 2. točki (b) ovog članka, jedino ako udovoljavaju sljedećim uvjetima:

(a) mogu se otpremati jedino tijekom određenih godišnjih razdoblja, ovisno o aktivnosti insekata koji prenose bolest;

(b) na dan pregleda iz članka 4. stavka 1. ovog Pravilnika ne smiju pokazivati kliničke simptome konjske kuge;

(c) – ukoliko nisu cijepljeni protiv konjske kuge, moraju biti pretraženi na konjsku kugu imunoenzimnim testom (ELISA) kako je opisana u Prilogu C ovoga Pravilnika, i to dvokratno u razmaku od 21 do 30 dana s negativnim rezultatom, pri čemu se drugo pretraživanje mora obaviti u razdoblju od 10 dana prije otpreme,

– ukoliko su cijepljeni, cijepljenje je zabranjeno tijekom prethodna dva mjeseca, a životinje moraju biti podvrgnute imunoenzimnom testu (ELISA), kako je opisan u Prilogu C ovoga Pravilnika i to u razmacima navedenim u točki c), ovoga stavka, koji ne pokazuje povećanje broja protutijela.

(d) najmanje 40 dana prije otpreme moraju provesti u karantenskom objektu;

(e) tijekom karantene te tijekom prijevoza iz karantenskog objekta do mjesta otpreme moraju biti zaštićeni od insekata koji prenose bolest.

POGLAVLJE III.

UVOZ I PROVOZ KOPITARA

Članak 6.

Da bi se mogli uvesti na područje Republike Hrvatske, kopitari moraju dolaziti iz države ili dijela države iz koje je odobren uvoz ili provoz.

Članak 7.

1) Kopitari moraju dolaziti iz države:

(a) slobodne od konjske kuge;

(b) u kojoj u zadnje dvije godine nije bilo pojave venezuelskog encefalomijelitisa konja (VEE);

2) Nadležno tijelo može:

(a) odlučiti da se odredbe stavka 1. ovog članka primjenjuju na dio područja države, a ukoliko se zahtjevi vezani za konjsku kugu primjenjuju na dio područja, moraju biti ispunjene mjere propisane člankom 5. stavcima 2. i 3. ovoga Pravilnika;

(b) zahtijevati dodatna jamstva za egzotične bolesti.

Članak 8.

1) Prije utovara, kopitari moraju neprekidno boraviti na području ili dijelu područja države utvrđenog u skladu s člankom 7. stavkom 2. točkom (a) ovoga Pravilnika, tijekom razdoblja određenog u skladu s člankom 9. ovoga Pravilnika.

2) Kopitari moraju dolaziti s gospodarstva koje je pod veterinarskim nadzorom.

Članak 9.

Uvoz ili provoz dozvoljen je ako:

(a) kopitari udovoljavaju veterinarsko-zdravstvenim uvjetima propisanim za određenu vrstu i kategoriju kopitara, u skladu sa člancima 4. i 5. ovoga Pravilnika.

(b) se radi o zemlji koja najmanje zadnjih šest mjeseci nije slobodna od vezikularnog stomatitisa ili virusnog arteritisa, uz uvjet da kopitari udovoljavaju sljedećim uvjetima:

– moraju dolaziti s gospodarstva na kojemu u zadnjih šest mjeseci nije bilo pojave vezikularnog stomatitisa i moraju negativno reagirati na serološki test prije otpreme;

– u slučaju pojave virusnog arteritisa, muška grla kopitara, bez obzira na članak 12. podstavak 2. ovoga Pravilnika, moraju negativno reagirati na serološki test ili na test izolacije virusa odnosno drugi priznati test koji jamči da su životinje slobodne od virusa.

Članak 10.

1) Kopitari moraju biti identificirani u skladu s člankom 4. stavkom 4. ovoga Pravilnika i mora ih pratiti međunarodna veterinarsko-zdravstvena svjedodžba koju je izdao nadležni veterinar zemlje izvoznice, koja mora:

(a) biti izdana na dan utovara životinja u svrhu slanja na odredište ili, ako se radi o registriranim konjima, na zadnji radni dan prije utovara,

(b) biti napisana na hrvatskom jeziku i jeziku zemlje izvoznice,

(d) potvrđivati da životinje ispunjavaju zahtjeve ovoga Pravilnika,

(e) biti napisana na jednom listu papira,

(f) biti izdana za jednog primatelja ili, ako se radi o životinjama za klanje, za pošiljku, pod uvjetom da su životinje propisno označene i identificirane.

2) Svjedodžba iz stavka 1. ovog članka izdaje se na obrascu Priloga B ovoga Pravilnika.

Članak 11.

Odmah po dolasku na odredište, kopitari za klanje otpremaju se u klaonicu te se u skladu s veterinarsko-zdravstvenim uvjetima, moraju zaklati u roku 72 sata.

Članak 12.

Nadležno tijelo može odrediti:

– da se uvoz ili provoz iz pojedine države ili dijela pojedine države ograniči na određene vrste ili kategorije kopitara,

– bez obzira na članak 9. ovoga Pravilnika, posebne uvjete za privremeni ulazak registriranih kopitara ili kopitara za posebne namjene ili njihov ponovni ulazak na područje Republike Hrvatske nakon privremenog izvoza;

– uvjete za promjenu privremenog ulaska u trajni ulazak.

Članak 13.

Prilozi A, B, i C tiskani su u prilogu ovog Pravilnika i čine njegov sastavni dio.

Članak 14.

Ovaj Pravilnik stupa na snagu osmoga dana od dana objave u »Narodnim novinama«.

Klasa: 322-01/05-01/265

Urbroj: 525-6-05-04

Zagreb, 7. lipnja 2005.

Ministar

Petar Čobanković, v. r.

PRILOG A

BOLESTI KOPITARA KOJE SE OBVEZNO PRIJAVLJUJU

Nadležnom tijelu, u skladu s posebnim propisima, obvezno se prijavljuju sljedeće bolesti kopitara:

– durina,

– maleus,

– encefalomijelitis konja (svi tipovi uključujući i VEE),

– infekciozna anemija,

– bjesnoća,

– bedrenica,

– konjska kuga,

– vezikularni stomatitis.

PRILOG B

MEĐUNARODNA VETERINARSKO--ZDRAVSTVENA SVJEDODŽBA

Putovnica br. ________________

Ja, dolje potpisani, potvrđujem ^a) da prethodno opisani kopitari ispunjavaju sljedeće uvjete:

1) danas su pregledani i nisu utvrđeni nikakvi klinički znaci bolesti;

2) nisu namijenjeni klanju u skladu s nacionalnim programom suzbijanja zaraznih ili prenosivih bolesti;

3) ne dolaze s područja ili dijela područja države koja je pod zabranom zbog konjske kuge ^b), ili

– dolaze s područja ili dijela područja države koja je bila predmet zabrana zbog veterinarsko-zdravstvenih razloga i da su u karantenskom objektu podvrgnuti, s negativnim rezultatima testova navedenim u Prilogu C ovoga Pravilnika

_________________između________________. i ________________^b);

– nisu cijepljeni protiv konjske kuge, ili su bili cijepljeni protiv konjske kuge dana ________________^{b) c)};

______
a) Vrijedi 10 dana.

b) Obrisati po potrebi.

c) Datum cijepljenja mora biti upisan u putovnicu.

4) ne potječu s gospodarstva koje je pod zabranom zbog veterinarsko-zdravstvenih razloga, niti su bili u dodiru s kopitarima s gospodarstva koje je pod zabranom zbog veterinarsko-zdravstvenih razloga:

– tijekom šest mjeseci u slučaju kopitara sumnjivih na durinu, počevši od dana stvarnog ili mogućeg dodira s bolesnom životinjom. Međutim, kada se radi o pastuhu, zabrana se primjenjuje dok životinja nije kastrirana,

– tijekom šest mjeseci u slučaju sakagije ili konjskog encefalomijelitisa, počevši od dana kada su životinje zaražene tim bolestima zaklane,

– u slučaju infekciozne anemije, do dana kada su zaražene životinje zaklane a preostale životinje su negativno reagirale nakon podvrgavanja pretrazi Coggins testom provedenim dva puta u razmaku od tri mjeseca,

– tijekom šest mjeseci u slučaju vezikularnog stomatitisa,

– u slučaju bjesnoće, tijekom jednog mjeseca od posljednjeg zabilježenog slučaja,

– u slučaju bedrenice, tijekom 15 dana od posljednjeg zabilježenog slučaja,

– ukoliko su sve vrste životinja osjetljive na bolest smještene na gospodarstvu zaklane i objekti dezinficirani, razdoblje zabrane je 30 dana, počevši od dana kada su životinje uništene i objekti dezinficirani, osim u slučaju bedrenice kada je period zabrane 15 dana.

5) koliko mi je poznato, životinja nije bila u dodiru s kopitarima oboljelim od neke zarazne ili prenosive bolesti u razdoblju 15 dana prije ove izjave.

6) stanje životinja utvrđeno u trenutku pregleda dopušta njihov prijevoz na planiranom putovanju u skladu s odredbama važećeg Pravilnika o zaštiti životinja tijekom prijevoza.

Datum	Mjesto	Pečat i potpis ovlaštenog veterinara (¹)

(¹) Zvanje i ime velikim tiskanim slovima.

PRILOG C

DIJAGNOSTIKA KONJSKE KUGE

Reagensi za dolje opisane imunoenzimne testove (ELISA) mogu se dobiti u referentnom laboratoriju Europske zajednice ili OIE-ovim referentnim laboratorijima za dijagnosticiranje konjske kuge.

1. KOMPETITIVNI TEST ELISA ZA OTKRIVANJE PROTUTIJELA ZA VIRUS KONJSKE KUGE (VKK) (PROPISANI TEST)

Kompetitivni ELISA test upotrebljava se za otkrivanje specifičnih protutijela za VKK u serumu bilo koje vrste kopitara. Serum zamorca protiv VKK (u daljnjem tekstu ‘antiserum zamorca’) je poliklonski imuni serum širokog spektra koji je specifičan i kojim je moguće prepoznati sve poznate serotipove virusa konjske kuge.

Test se temelji na onemogućavanju vezivanja antigena VKK i antiseruma zamorca dodavanjem uzorka ispitivanog seruma ukoliko je pozitivan. Protutijela za VKK u uzorku ispitivanog seruma pokazuju veći afinitet prema antigenima VKK, te će se smanjiti vezivanje antiseruma zamorca za iste, što rezultira smanjenjem očekivane obojenosti (nakon dodavanja enzimom označenih anti-zamorčevih protutijela i supstrata). Serumi se mogu testirati pri jednom razrjeđenju od 1: 5 (metoda pretraživanja seruma pri jednom razrjeđenju) ili se mogu titrirati (metoda titracije seruma) kako bi se dobile završne točke razrjeđenja.

Vrijednosti inhibicije veće od 50 % mogu se smatrati pozitivnim.

Dolje opisani protokol ispitivanja primjenjuje se u Regionalnome referentnom laboratoriju za konjsku kugu u Pirbrightu, u Ujedinjenom Kraljevstvu.

1.1 Opis testa

1.1.1 Pripremanje plitica

1.1.1.1 Na ELISA plitice nanesite antigen VKK koji je ekstrahiran iz zaraženih staničnih kultura i razrijeđen u karbonatnom/ bikarbonatnom puferu, pH 9,6. Inkubirajte ELISA plitice preko noći na 4 °C.

1.1.1.2 Isperite plitice tri puta tako što ćete puniti i prazniti jažice fosfatnim puferom (PBS), pH 7,2 do 7,4 pH, te ih osušite na upijajućem papiru.

1.1.2 Kontrolne jažice

1.1.2.1 Titrirajte pozitivne kontrolne serume u serijama dvostrukog razrjeđenja, od 1: 5 do 1: 640, duž stupca 1 u blokirajućem puferu (PBS koji sadrži 0,05 % (v/v)Tween-20, 5,0 % (w/v) obranog mlijeka u prahu (Cadbury’s Marvel TM) i 1 % (v/v) goveđeg seruma) kako biste dobili konačni volumen od 50 µl po jažici.

1.1.2.2 U jažice A i B u stupcu 2 dodajte 50 µl negativnog kontrolnog seruma u razrjeđenju od 1: 5 (10 µl seruma + 40 µl blokirajućeg pufera).

1.1.2.3 U jažice C i D u stupcu 2 dodajte po 100 µl blokirajućeg pufera (slijepa kontrola).

1.1.2.4 U jažice E, F, G i H u stupcu 2 dodajte po 50 µl blokirajućeg pufera (kontrolni serum zamorca).

1.1.3. Ispitivanje seruma pri jednom razrjeđenju

1.1.3.1 U dvije jažice u stupcima 3 do 12 dodajte svaki ispitivani serum razrijeđen u blokirajućem puferu u omjeru 1:5 (10 µl seruma + 40 µl blokirajućeg pufera).

ili

1.1.4 Metoda titracije seruma

1.1.4.1 Pripremite serije dvostrukog razrjeđenja svakog pretraživanog uzorka (1: 5 do 1: 640) u blokirajućem puferu u osam jažica svakog pojedinog stupca (3 do 12).

potom

1.1.5 U sve jažice na ELISA plitici, osim u jažice slijepe kontrole, dodajte po 50 µl antiseruma zamorca, prethodno razrijeđenog u blokirajućem puferu (sada sve jažice sadrže konačni volumen od 100 µl).

1.1.5.1 Inkubirajte 1 sat na 37 °C na rotacijskoj tresilici.

1.1.5.2 Plitice isperite tri puta te osušite kao prije.

1.1.5.3 U svaku jažicu dodajte 50 µl kunićjeg anti-zamorčevog konjugata obilježenog peroksidazom iz hrena (HRP), prethodno razrijeđenog u blokirajućem puferu.

1.1.5.4 Inkubirajte 1 sat na 37 °C na rotacijskoj tresilici.

1.1.5.5 Plitice isperite tri puta te osušite kao prije.

1.1.6 Kromogen

Pripremite otopinu kromogena OPD (OPD = orto-fenildiamin) prema uputama proizvođača (0,4 mg/ml u sterilnoj destiliranoj vodi) neposredno prije uporabe. Dodajte supstrat (vodikov peroksid = H2O2) kako biste dobili konačnu koncentraciju od 0,05 % (v/v)(1: 2000 30 %-tne otopine H2O2).

U svaku jažicu dodajte 50 µl otopine OPD i ostavite plitice 10 minuta na temperaturi okoline. Zaustavite reakciju dodajući u svaku jažicu po 50 µl 1M sumporne kiseline (H2SO4).

1.1.7 Očitavanje rezultata

Rezultat očitajte spektrofotometrijski na 492 nm.

1.2 Izražavanje rezultata

1.2.1 Koristeći računalni programski paket ispišite vrijednosti optičke gustoće (OD) te postotak inhibicije (PI) za pretraživane i kontrolne serume temeljene na srednjoj vrijednosti koja je zabilježena u četiri jažice s kontrolnim serumom zamorca.

Na temelju podataka izraženih kao OD i PI vrijednosti određuje se je li uspješnost testa bila unutar prihvatljivih granica. Gornje kontrolne granice (GKG) i donje kontrolne granice (DKG) za kontrolni serum zamorca nalaze se između OD vrijednosti 1,4 odnosno 0,4. Titar završne točke pozitivne kontrole na temelju 50 % PI treba biti 1:240 (u rasponu od 1:120 do 1:480).

Treba odbaciti svaku pliticu koja ne ispunjava gore navedene kriterije. Međutim, mogu se prihvatiti negativni ispitivani uzroci ako je titar pozitivnog kontrolnog seruma veći od 1:480, a ispitivani uzorci su još uvijek negativni.

Jažice s negativnim kontrolnim serumom u duplikatu i jažice za slijepu kontrolu u duplikatu trebaju doseći PI vrijednosti između + 25 % i – 25 %, odnosno između + 95 % i + 105 %. Ukoliko vrijednosti nisu unutar ovih granica, ne znači da je plitica neprihvatljiva nego upućuje na to da se razvija pozadinska boja.

1.2.2 Dijagnostički prag (granična vrijednost) za pretraživane serume je 50 % (PI 50 %). Uzorci čije su PI vrijednosti veće od 50 % ocjenjuju se kao pozitivni. Uzorci čije su PI vrijednosti manje od 50 % ocjenjuju se kao negativni.

Uzorci čije su PI vrijednosti iznad i ispod praga kod jažica u duplikatu smatraju se sumnjivim. Ti se uzorci mogu ponovo ispitati testom s jednim razrjeđenjem ili titracijom. Pozitivni se uzorci mogu također titrirati kako bi se utvrdio njihov titar.

Prikazivanje rezultata testa s jednim razrjeđenjem

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
	+ kont.	Pretraživani serumi
A	1:5	– kont.	31	32	33	34	35	36	37	38	39	40
B	1:10	– kont.	31	32	33	34	35	36	37	38	39	40
C	1:20	Slijepa kont.
D	1:40	Slijepa kont.
E	1:80	SZ kont.
F	1:160	SZ kont.
G	1:320	SZ kont.	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
H	1:640	SZ kont.	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
– kont. = negativna kontrola. + kont. = pozitivna kontrola. SZ kont. = kontrolni serum zamorca.

Pretraživani serum

+ kont.

Pretraživani serum

1:5

–kont.

1:5

1:10

–kont.

1:10

1:20

Slijepa kont.

1:20

1:40

Slijepa kont.

1:40

1:80

SZ kont.

1:80

1:160

SZ kont.

1:160

1:320

SZ kont.

1:320

1:640

SZ kont.

1:640

– kont. = negativna kontrola.

+ kont. = pozitivna kontrola.

SZ kont. = kontrolni serum zamorca.

2. INDIREKTNI TEST ELISA ZA OTKRIVANJE PROTUTIJELA ZA VIRUS KONJSKE KUGE (VKK) (PROPISANI TEST)

Test koji se opisuje u daljnjem tekstu u skladu je s opisom testa iz poglavlja 2.1.11. OIE-ovog Priručnika o normama za dijagnostičke testove i cjepiva, četvrto izdanje, 2000.

Rekombinantni protein VP7 koristio se kao antigen za otkrivanje protutijela usmjerenih protiv virusa konjske kuge, uz visoki indeks osjetljivosti i specifičnosti. Njegove prednosti su i u tome što je stabilan i nije infektivan.

2.1 Opis testa

2.1.1 Čvrsta faza

2.1.1.1 Na ELISA plitice nanesite VKK-4 VP7 razrijeđen u karbonatnom/ bikarbonatnom puferu, pH 9,6. Inkubirajte plitice preko noći na 4 °C.

2.1.1.2 Plitice isperite pet puta destiliranom vodom koja sadrži 0,01 % (v/v) Tween 20 (otopina za ispiranje).

Lagano pritisnite plitice na upijajući materijal (staničevinu ili celuloznu vatu) kako bi se odstranili ostaci otopine za ispiranje.

2.1.1.3 Plitice blokirajte stavljajući u svaku jažicu 200 µl fosfatnog pufera (PBS)+ 5 % (w/v) obranog mlijeka (Nestlé Dry Skim Milk TM) i ostavite 1 sat na 37 °C.

2.1.1.4 Uklonite blokirajuću otopinu i lagano pritisnite plitice na upijajući materijal.

2.1.2 Uzorci za pretraživanje

2.1.2.1 Uzorci seruma koji se pretražuju te pozitivni i negativni kontrolni serumi razrjeđuju se 1:25 u PBS + 5 % (w/v) obranog mlijeka + 0,05 % (v/v)Tween 20, 100 µl po jažici. Inkubirajte 1 sat na 37 °C.

Za titraciju pripremite serije dvostrukog razrjeđenja od 1:25 (100 µl po jažici), koristeći jedan stupac plitice za svaki serum, te isto učinite s pozitivnim i negativnim kontrolama. Inkubirajte 1 sat na 37 °C.

2.1.2.2 Isperite plitice kako je opisano pod 2.1.1.2.

2.1.3 Konjugat

2.1.3.1 U svaku jažicu stavite po 100 µl anti-konjskih gamaglobulina konjugiranih peroksidazom iz hrena (HRP), razrijeđenih u PBS-u + 5 % mlijeka + 0,05 % Tween 20, pH 7,2. Inkubirajte 1 sat na 37 °C.

2.1.3.2 Isperite plitice kako je opisano pod 2.1.1.2.

2.1.4 Kromogen/Supstrat

2.1.4.1 U svaku jažicu dodajte 200 µl otopine kromogena/supstrata (10 ml 80,6 mM DMAB (dimetilaminobenzaldehid)+ 10 ml 1,56 mM MBTH (3-metil-2-benzo -tiazolin hidrazon hidroklorid)+ 5 µl H2O2)

Razvijanje boje zaustavite dodavanjem 50 µl 3N H2SO4 nakon približno 5 do 10 minuta (prije nego se počne bojiti negativna kontrola).

Mogu se upotrebljavati i drugi kromogeni kao što su ABTS (2,2’-azino-bis -[3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kiselina]), TMB (tetrametil benzidin), ili OPD (orto-fenildiamin).

2.1.4.2 Plitice očitajte na 600 nm (ili 620 nm).

2.2 Tumačenje rezultata

2.2.1 Izračunajte graničnu vrijednost tako što ćete vrijednosti negativne kontrole dodati 0,6 (0,6 je standardna devijacija dobivena sa skupinom od 30 negativnih seruma).

2.2.2 Pretraživani uzorci koji daju vrijednosti apsorbancije niže od granične vrijednosti smatraju se negativnim.

2.2.3 Pretraživani uzorci koji daju vrijednosti apsorbancije veće od granične vrijednosti + 0,15 smatraju se pozitivnim.

2.2.4 Pretraživani uzorci koji daju vrijednosti apsorbancije između pozitivnih i negativnih sumnjivi su te se mora primijeniti dodatna metoda kako bi se rezultat potvrdio.

3. BLOKIRAJUĆI TEST ELISA ZA OTKRIVANJE PROTUTIJELA ZA VIRUS KONJSKE KUGE (VKK) (PROPISANI TEST)

Blokirajući test ELISA namijenjen je otkrivanju specifičnih protutijela za VKK u serumima svih vrsta prijemljivih na bolest. VP7 je glavni, antigenski, virusni protein VKK-a, i sačuvan je u devet serotipova. Budući da je monoklonsko protutijelo (Mpt) usmjereno i protiv VP7, test pruža visoku razinu osjetljivosti i specifičnosti.

Nadalje, rekombinantni VP7 antigen je potpuno neškodljiv te stoga jamči visoki stupanj sigurnosti.

Test se temelji na prekidanju reakcije između rekombinantnog VP7, kao antigena vezanog na ELISA pliticu, i konjugiranog Mpt specifičnog za VP7. Protutijela u pretraživanim serumima blokirat će reakciju između antigena Mpt, što će dovesto do smanjenja obojenja.

Test koji se opisuje u daljnjem tekstu izvodi se u Referentnom laboratoriju Europske zajednice za konjsku kugu u Algeteu u Španjolskoj.

3.1 Opis testa

3.1.1 ELISA plitice

3.1.1.1 Na ELISA plitice nanesite rekombinantni VKK-4 VP7 razrijeđen u karbonatnom/ bikarbonatnom puferu, pH 9,6. Inkubirajte ELISA plitice preko noći na 4 °C.

3.1.1.2 Plitice isperite pet puta fosfatnim puferom (PBS) koji sadrži 0,05% (v/v)Tween 20 (PBST).

3.1.1.3. Stabilizirajte plitice stabilizirajućom otopinom (kako bi se omogućilo dugotrajno čuvanje na 4 °C bez gubitka aktivnosti) te ih osušite na upijajućem materijalu.

3.1.2 Pretraživani uzorci i kontrole

3.1.2.1 Za pregled: pretraživane serume i kontrole izravno na plitici razrijedite 1:10 u PBST-u kako biste u svakoj jažici dobili konačni volumen od 100 µl. Inkubirajte 1 sat na 37 °C.

3.1.2.2 Za titraciju: pripremite seriju dvostrukog razrjeđenja pretraživanih seruma i pozitivnih kontrola (100 µl/jažica) od 1:10 do 1:1280 u osam jažica.

Negativna se kontrola testira pri razrjeđenju 1:10.

3.1.3 Konjugat

U svaku jažicu dodajte 50 µl prethodno razrijeđenih Mpt (monoklonska protutijela specifična za VP7) konjugiranih peroksidazom iz hrena te lagano promiješajte kako biste osigurali homogenost. Inkubirajte 30 minuta na 37 °C.

3.1.4 Plitice pet puta isperite PBST-om te osušite kao ranije.

3.1.5 Kromogen/Supstrat

U svaku jažicu dodajte 100 µl otopine kromogena/supstrata (1 ml ABTS (2,2’-azino-bis -[3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kiselina]) 5 mg/ml + 9 ml supstratnog pufera (0,1 M fosfat-citratni pufer s pH 4 koji sadrži 0,03 % H2O2] te inkubirajte 10 minuta na sobnoj temperaturi.

Razvijanje boje se zaustavlja tako da se u svaku jažicu doda 100 µl 2 %-nog (w/v) SDS-a (natrij dodecil sulfat).

3.1.6 Očitavanje rezultata

Rezultate očitajte pri 405 nm u ELISA čitaču.

3.2 Tumačenje rezultata

3.2.1 Validacija testa

Test je valjan ako je optička gustoća (OD) negativne kontrole (NK) veća od 1,0 i ako je OD pozitivne kontrole (PK) manji od 0,2.

3.2.2 Izračunavanje granične vrijednosti

Pozitivna granična vrijednost = NK – ((NK – PK)x 0,3)

Negativna granična vrijednost = NK – ((NK – PK)x 0,2)

NK je optička gustoća negativne kontrole, a PK je optička gustoća pozitivne kontrole.

3.2.3 Tumačenje rezultata.

Uzroke kod kojih je OD manji od pozitivne granične vrijednosti treba smatrati pozitivnim na protutijela za VKK.

Uzorke kod kojih je OD veći od negativne granične vrijednosti treba smatrati negativnim na protutijela za VKK.

Uzroke kod kojih je OD između te dvije vrijednosti treba smatrati sumnjivim te bi se kod tih životinja trebalo ponovo obaviti uzorkovanje nakon dva do tri tjedna.